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產(chǎn)品簡介
CAR/TCR 基因拷貝數(shù)檢測試劑盒是用于定量檢測來源于 HIV-1 型慢病毒載體技術(shù)制備的 CAR-T/TCR-T/CAR-NK 細(xì)胞基因組中CAR 基因拷貝數(shù)檢測的專用試劑盒。
貨號： HG-CA001
本試劑盒用于核酸的提取、富集、純化等步驟，其處理后的產(chǎn)物可用于臨床體外檢測使用。
本試劑盒使用超順磁性微球可以特異性的吸附 DNA，通過洗滌去除 DNA 以外的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA，分離純化得到高質(zhì)量核酸。
檢測范圍：3×101 copies/μL~3×106 copies/μL
100 Reactions
| 組分 | 規(guī)格 | 存儲條件 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| CAR 定量參考品（3×108 copies/μL ） | 50μL×1 管 | -20℃ | |||
| CAR Primer&Probe Mix | 550μL×1 管 | -20℃ | |||
| 2× qPCR Reaction Buffer | 1.2mL×1 管 | -20℃ | |||
| DNA 稀釋液 | 1.5mL×3 管 | -20℃ | |||
| ROX High | 50μL×1 管 | -20℃ | |||
| ROX Low | 50μL×1 管 | -20℃ |
存儲條件見上表，有效期 18 個月。
◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機(jī)型使用時，請注意選擇適配的參比染料 ROX
| 儀器 | ROX參比染料 |
| Applied Biosystems®5700,7000,7300,7700,7900HT,StepOneTM,and StepOnePlusTTM | ROX High |
| Applied Biosystems®7500,ViiATM 7,QuantStudioTM12K Flex,Agilent Mx3000PTM,Mx3005PTM,and Mx4000TM | ROX Low |
| Rotor-GeneTM,DNA Engine OpticonTM,OpticonTM2,Chromo 4TMReal-Time Detector,Mastercycler®ep realplex, Smart Cycler®,Roche LightCycle®480,Roche LightCycler®Nano,Bio-Rad CFX96,and llumina EcoTM | No ROX |
◆ 1.5mL 或 2mL 無菌低吸附離心管
◆ 離心機(jī)
◆ 熒光定量 PCR 儀
◆ 與 PCR 儀適配的 96 孔 qPCR 板或八聯(lián)排管
◆ 震蕩器
◆ 1000μL，200μL，10μL 無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 各規(guī)格移液器（如 1000μL，200μL，10μL，2.5μL 等）
詳見血液 / 組織 / 細(xì)胞基因組 DNA 純化提取試劑盒（貨號為 HG-NA100）操作說明書。
1.1 定量參考品：取出 CAR 定量參考品、DNA 稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時離心；
1.2 取 7 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標(biāo)記為 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；
1.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程如下表：
標(biāo)準(zhǔn)品代號 | 稀釋體積 | 濃度(copies/μL) |
STO | 10μL定量參考品+90μL DNA稀釋液 | 3×10? |
ST1 | 10μL STO+90μL DNA稀釋液 | 3×106 |
ST2 | 10μLST1+90μL DNA稀釋液 | 3×10? |
ST3 | 10μL ST2+90μL DNA稀釋液 | 3×10? |
ST4 | 10μL ST3+90μL DNA稀釋液 | 3×103 |
ST5 |
|
|
ST6 | 10μL ST5+90μL DNA稀釋液 | 3×101 |
1.4 NTC 的制備：100uL DNA 稀釋液；
1.5 NCS 的制備 : 隨樣品取 100μL DNA 稀釋液進(jìn)行樣品預(yù)處理。
2.1 根據(jù)所需檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品數(shù)量（一般做 3 個復(fù)孔），計算所需孔數(shù)：
反應(yīng)孔數(shù) =（6 個濃度梯度的標(biāo)曲 +2 個陰性對照 NTC 和 NCS + 待測樣品）×3
2.2 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算本次所需的 qPCR Mix 總量：
qPCR Mix =（反應(yīng)孔數(shù) +2 或 3）× 15μL（2 或 3 為操作損失量）
2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制 qPCR Mix。
| 組分 | 單個反應(yīng)量 (μL) |
| 2× qPCR Reaction Buffer | 10 |
| CAR Primer&Probe Mix | 4.6 |
| ROX* | 0.4 |
| 總體積 | 15 |
| 參考品 | 15μL qPCR Mix +5μL ST1/2/3/4/5/6 |
| 陰性對照 | 15μL qPCR Mix +5μL NTC/NCS |
| 待測樣品 | 15μL qPCR Mix +5μL 待測樣本 |
各反應(yīng)孔加樣示例
4.實(shí)驗(yàn)需使用qPCR實(shí)驗(yàn)專用的八聯(lián)管或者96孔板進(jìn)行反應(yīng)，需去除反應(yīng)體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準(zhǔn)備反應(yīng)。
5.反應(yīng)孔排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
| B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
| C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
| D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
| E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
| F | ST6 | ST6 | ST6 | ERC -S1 | ERC -S1 | ERC -S1 | ||||||
| G | NTC | NTC | NTC | ERC -S2 | ERC -S2 | ERC -S2 | ||||||
| H | NCS | NCS | NCS | ERC -S3 | ERC -S3 | ERC -S3 |
96孔板排版示例
（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）
1.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)程序，設(shè)置兩步法反應(yīng)程序如下表：
| Stagel | 預(yù)變性 | Reps:1 | 95℃ | 10min |
| Stage2 | 循環(huán)反應(yīng) | Reps:40 | 95℃ | 15s |
| 60℃ | 60s |
2.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板，點(diǎn)擊 Select Fluorophores 選擇熒光 FAM 和 Cy5；
在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為Human-DNA；輸入每個樣品的重復(fù)次數(shù)及Sample Name；
在反應(yīng)板圖表中，選擇標(biāo)曲孔，在 SampleType 中下拉選擇 Standard，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 CAR；勾選熒光 Cy5，Target Name 命名為 RFG，輸入每個稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及 SampleName。并且分別在 ST1， ST2， ST3，ST4，ST5，ST6 的 Concentration 一欄賦值為 3E+06、3E+05、3E+04、3E+03、3E+02、3E+01( 單位為 copies/uL) 。
3.點(diǎn)擊 Run 界面“Start Run"按鈕進(jìn)行 PCR 測定。4.點(diǎn)擊Run界面“Start Run"按鈕進(jìn)行PCR測定。
以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點(diǎn)擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴(kuò)增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為copies/μL。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應(yīng)小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照NTC和NCS的CT值都應(yīng)大于標(biāo)曲最i低濃度的CT值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，擴(kuò)增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標(biāo)回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。
4. 結(jié)果計算：CAR 拷貝數(shù) / 細(xì)胞 = 2 x CAR / RFG
1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴
好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。
5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。
6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測效果。
7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。
9. 公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，
預(yù)留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。
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柏萊源（天津）生物科技有限公司的優(yōu)勢：
現(xiàn)貨供應(yīng)：公司庫存充足，可快速發(fā)貨，減少用戶等待時間。
效期保障：嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量，確保試劑效期新鮮，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
專業(yè)技術(shù)支持：提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)指導(dǎo)，幫助用戶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高實(shí)驗(yàn)成功率。
定制化服務(wù)：根據(jù)用戶需求，提供個性化的產(chǎn)品和服務(wù)解決方案。
售后保障：完善的售后服務(wù)體系，及時解決用戶在使用過程中遇到的問題。
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