貨號： HG-EA001

產品簡介：

E1A & SV40LTA 殘留 DNA 檢測試劑盒能快速、特異地檢測生物制品中宿主細胞來源的 E1A 和 SV40LTA 的 DNA 殘留。
本試劑盒利用熒光探針原理，采用多重 qPCR 方法，檢測快速，專一性強，最i低檢測限可以達到 40copies/µL。試劑盒配套 E1A&SV40LTA 定量參考品（已完成標準品溯源）。檢測范圍：4×10¹copies/µL~4×10⁶copies/µL換算公式：質?？截悢担╟opies/μL）=6.02×10¹⁴× 質粒濃度（ng/μL）/（質粒堿基數 ×660）

規格：

100 Reactions

產品組成：

產品儲存條件與有限期：

存儲條件見上表，有效期12個月。

適用機型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機型使用時，請注意選擇適配的參比染料 ROX

需要準備的耗材與設備：

實驗前請準備好下列耗材與設備：
◆1.5mL或2mL無菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯排管
◆ 1000μL，200μL，10μL無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴

◆ 離心機
◆ 震蕩器
◆ 各規格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架

實驗步驟：

一、 樣品前處理

詳見樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）操作說明書。

二、 qPCR操作步驟

1. 定量參考品及NCS、NTC的制備
 1.1 定量參考品：即用型；

 1.2 NTC 的制備：100uL DNA稀釋液；

 1.3 NCS 的制備：取100μL DNA稀釋液與樣本一同進行樣本前處理；

 1.4 加標回收ERC：建議90uL樣品+10uL 定量參考品3，也可根據實際情況按照其他方式制備；

2. q-PCR 反應液的制備和加樣
 2.1 根據反應孔數計算本次所需的 E1A&SV40LTA qPCR Mix 總量：
       E1A&SV40LTA qPCR Mix =（反應孔數 +2 或 3）×20μL（2 或 3 為操作損失量）
 2.2 根據反應孔數計算本次所需的 qPCR Mix 總量：
       qPCR Mix=（反應孔數 +2 或 3）× 15μL（2 或 3 為操作損失量）
 2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表 2 所示配制 E1A&SV40LTA qPCR Mix。

E1A&SV40LTA qPCR Mix 配制表

3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積30μL）：

各反應孔加樣示例

4.實驗需使用qPCR實驗專用的八聯管或者96孔板進行反應，需去除反應體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準備反應。
5.反應孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反應程序和參數設置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）

1.創建實驗反應板，點擊Select Fluorophores選擇熒光FAM；在反應板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為E1A-DNA；勾選熒光CY5，Target Name命名為SV40LTA-DNA；輸入每個樣品的重復次數及Sample Name。

2.在反應板圖表中，選擇標曲孔，在Sample Type中下拉選擇Standard，勾選熒光FAM，Target Name命名為E1ADNA；勾選熒光CY5，Target Name命名為SV40LTA-DNA；輸入每個稀釋梯度的重復次數及Sample Name。分別在STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6的Concentration一欄賦值為4E+06、4E+05、4E+04、4E+03、4E+02、4E+01（單位為copies/μL）。

3.點擊Run界面“Start Run"按鈕進行PCR測定。

備注：反應體積30μL。程序中60℃ 30s處設置為熒光收集；有些儀器不允許熒光收集步驟設置為30s或更短，使用ABI 7000、ABI 7300及ABI 7500時可改為35s，其他設備可咨詢儀器廠家

四、 qPCR結果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴增效率（Effect）、R²。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。
3. 數據可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照NTC和NCS的CT值都應大于標曲最i低濃度的CT值或根據實驗室自身驗證結果設定標準；
• 標準曲線線性相關系數R²≥0.98，擴增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。

注意事項：

1. 本試劑盒已通過穩定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。 

2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環境需區分區域，不可在一個區域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。 

3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。 

4. 試劑盒必須在有效期內使用。 

5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環境融化后使用。 

6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優良檢測效果。 

7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續qPCR檢測，以保證檢測結果的準確性。 

8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環境密切相關。 

9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。 

10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴格把控產品質量，確保試劑效期新鮮，保障實驗結果的可靠性。

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